本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及一种检测非那雄胺中遗传毒性杂质的方法及其应用。所述方法包括通过高效液相色谱法进行检测，所述高效液相色谱法中，采用流动相A和流动相B进行洗脱；所述流动相A包括0.03‑0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，所述流动相B为乙腈。本发明通过对高效液相色谱法中的各项条件进行了优化，得以检测非那雄胺合成中的潜在遗传毒性杂质，尤其是结构非常类似的DDQ和DDHQ。同时，本发明提供的方法检测方法灵敏度高，准确度高，耐用性好，稳定性好。