本发明公开了一种敲除GS基因的CHO细胞株及其制备方法与应用。该CHO细胞株无GS蛋白表达且无嘌呤霉素抗性、无Cas9基因及sgRNA序列整合入细胞基因组中。本发明利用CRISPR/Cas9方法敲除GS基因，通过优化筛选方法，得到该CHO细胞株。本发明提供的制备方法能快速实现CHO细胞GS‑/‑编辑，筛选出GS基因敲除且无嘌呤霉素抗性、无Cas9基因及sgRNA序列整合的CHO GS‑/‑细胞株。该细胞株应用于重组蛋白表达，无需MSX介导的基因扩增过程，大大加快了高产细胞株筛选效率。